肺纖維化是由多種原因引起的急慢性間質(zhì)性 肺疾病，主要病因?yàn)闅馓撽幪摗⒎文I虧虛、痰瘀 互阻肺絡(luò)。近年來，肺間質(zhì)纖維化發(fā)病率有增高 趨勢(shì)，傳統(tǒng)的糖皮質(zhì)激素和細(xì)胞毒藥物療效不佳。 蟲草多糖是發(fā)酵蟲草菌粉中最主要的生物活性物 質(zhì)，蟲草發(fā)酵過程中產(chǎn)生的廢液(濾液)中還含有較 豐富的蟲草多糖。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，其具有抗氧化、 抗腫瘤、增強(qiáng)免疫等作用，也有抗大鼠肝纖維 化作用，但抗肺纖維化作用的報(bào)道尚不多見。本 實(shí)驗(yàn)研究從蟲草發(fā)酵廢液中提取得到的蟲草多糖 抗小鼠肺纖維化作用，為蟲草發(fā)酵廢液的合理應(yīng)用 和抗肺纖維化藥物的研發(fā)提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

蟲草菌粉和蟲草多糖各提取物均由杭州中美華東制藥有限公司 101 車間提供(批號(hào)分別為 ZYZJ001，HD101001)。蟲草多糖從蟲草發(fā)酵過程 產(chǎn)生的廢液中提取得到，總多糖含量高達(dá) 64%。 提取得到的蟲草總多糖經(jīng)過分離后得到相對(duì)分子 量(molecular mass，MW)<2×105 的蟲草多糖和 MW>2×105 的蟲草多糖。蟲草菌粉為百令膠囊的 原料。 注射用鹽酸平陽(yáng)霉素(天津太河制藥有限公 司，批號(hào)：171201)；小鼠白介素 1 受體抑制劑 (interleukin-1 receptor antagonist，IL-1RA)測(cè)定試 劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)： 11013651114)；羥脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)測(cè) 試劑盒 ( 南京建成生物工程研究所，批號(hào)： 20170818)；麗春紅、磷鉬酸(批號(hào)：F20070904， F20090116)均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酸性品紅 ( 上海三愛思試劑有限公司，批號(hào)： 20061109)；水溶苯胺藍(lán)(中國(guó)上海標(biāo)本模型廠，批 號(hào)：20070930)；二甲苯(衢州巨化試劑有限公司， 批號(hào)：20161101)；無水乙醇(安徽安特生物化學(xué)有 限公司，批號(hào)：1609113601)。

電子天平(德平賽多利斯)； Tissuelyser2 組織破碎機(jī)(德國(guó) Retsch 公司)； Sunrise-basic 光吸收酶標(biāo)儀(瑞士 Tecan 集團(tuán)公司)； Allegra 64R 離心機(jī)(貝克曼庫(kù)爾特公司產(chǎn)品)； XW-80A 漩渦混合器(上海醫(yī)大儀器廠)；JHS-080 型精密恒溫恒濕箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)； YD-335 電腦切片機(jī)、YD-A 智能型生物組織攤片 機(jī)均購(gòu)自浙江省金華市益迪醫(yī)療設(shè)備廠；420 型數(shù) 碼照相機(jī)(奧林巴斯)；BA310 生物顯微鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)。

ICR 小鼠 72 只，♀♂各半，體質(zhì)量 20~23 g， 由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)： SCXK(浙)2014-0001，合格證號(hào)：1801110028。分 為 6 組：空白組、模型組、蟲草菌粉組(陽(yáng)性對(duì)照)、 蟲草總多糖組、蟲草多糖(MW<2×105 )組和蟲草多 糖(MW>2×105 )組，每組 12 只。

除空白組外， 其余小鼠均造模。4%水合氯醛(0.01 mL·g?1 )腹腔 注射麻醉小鼠，固定，分離氣管，趁其吸氣瞬間 迅速注射藥物。其中造模動(dòng)物注射平陽(yáng)霉素，劑 量為 5.5 μg·g?1 ，空白組注射等量的生理鹽水，注 射完立即 360°水平旋轉(zhuǎn)小鼠，使藥液在肺內(nèi)均勻分布。

造模 1 周后，將造模動(dòng)物隨機(jī) 分組并開始給藥，各給藥組均按 500 mg·kg?1 灌胃 給藥(藥物均用純凈水溶解)，每天 1 次，連續(xù) 3 周。 空白組給予等量的純凈水。

末次給藥后，次日眼眶 取血，然后立即脫頸椎處死小鼠，開胸腔取肺組 織，一部分肺做消化，使用試劑盒測(cè)定 Hyp 含量。 部分肺組織通過支氣管注入 Bouin 液后并放入 Bouin 液中固定。血液離心 3 000 r·min?1 10 min 得 上清液血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定 IL-1RA 含量。

肺組織在 Bouin 液中固定 24 h 后梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，常規(guī)切片，行Masson 染色，觀察膠原沉 積，使用 Motic Med 6.0 數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)檢 測(cè)肺纖維化面積。

采用 SPSS 16.5 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn) 行單因素方差分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以 x ? s 表示，兩兩 比較采用 LSD-t 檢驗(yàn)，以 P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì) 學(xué)意義。

與空白組相比，造模后的小鼠體質(zhì)量顯著降 低，小鼠肺纖維化模型組血清中 IL-1RA 水平明顯 降低，肺組織中 Hyp 含量明顯升高(P<0.01)。與肺 纖維化模型組相比，蟲草菌粉組、蟲草總多糖組、 蟲草多糖(MW<2×105 )組的血清中 IL-1RA 水平均 明顯升高(P<0.05，P<0.01)，肺組織中 Hyp 的含量 均明顯降低(P<0.05，P<0.01)。結(jié)果見圖 1。

2.2 蟲草多糖對(duì)小鼠肺組織纖維化的影響

與空白組相比，模型組小鼠肺纖維化面積明 顯增大(P<0.01)。與模型組相比，蟲草總多糖組、 蟲草多糖(MW<2×105 )組的肺纖維化面積明顯減 小(P<0.05，P<0.01)，結(jié)果見表 1。各組小鼠肺組 織病理切片 Masson 染色圖見圖 2，肺纖維化模型 組小鼠的整個(gè)肺泡組織膠原纖維呈彌散性分布， 而蟲草菌粉組、蟲草總多糖組、蟲草多糖 (MW<2×105 )組的小鼠肺泡組織膠原纖維呈零星 的散在分布，特別是蟲草多糖(MW<2×105 )組的小 鼠肺組織染色趨近空白組。

   


3 討論

本研究采用在小鼠氣管內(nèi)一次性注射平陽(yáng)霉 素的方法制作肺間質(zhì)纖維化動(dòng)物模型。該方法具 有可靠性高、給藥劑量小、給藥次數(shù)少、造模時(shí) 間短等優(yōu)點(diǎn)。在肺間質(zhì)性病變過程中，早期是肺 泡炎及大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，后期是肺纖維化，大 量間質(zhì)細(xì)胞增生及膠原蛋白沉積。 單核巨噬細(xì)胞是 IL-1 的主要產(chǎn)生細(xì)胞，在肺 纖維化的發(fā)病過程中，IL-1 既可介導(dǎo)肺泡炎期的 損傷，又可促進(jìn)間質(zhì)損傷修復(fù)乃至過度修復(fù)引起 間質(zhì)纖維化。由單核巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞產(chǎn)生的 IL-1RA，可競(jìng)爭(zhēng)性地與 IL-1R 結(jié)合從而阻斷 IL-1 的活性。IL-1RA是重要的內(nèi)源性炎癥調(diào)節(jié)因子，能抑制中性粒細(xì)胞泡內(nèi)積聚，阻斷 IL-1 引起的前 列腺素 E2 釋放，提高血清中糖皮質(zhì)激素的濃度。 IL-1RA 以很高的親和力與 IL-1α、IL-1β 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié) 合IL-1R，但因?yàn)樗狈L-1R輔助蛋白(IL-1R-ACP) 結(jié)合的區(qū)域，故不具有進(jìn)一步激發(fā)信息傳導(dǎo)的功 能。IL-1RA 與具有信號(hào)傳導(dǎo)功能的 IL-1R 結(jié)合， 從而抑制 IL-1α、IL-1β 的活性，達(dá)到減輕纖維化 的作用。本文的研究結(jié)果顯示蟲草菌粉組、蟲草 總多糖、蟲草多糖(MW<2×105 )組可顯著升高模型 小鼠血清中 IL-1RA 水平，具有一定程度的抗纖維化作用。