動(dòng)物脂肪酸合酶（Fatty acid synthase，F(xiàn)AS）是體 內(nèi)催化合成長(zhǎng)鏈脂肪酸途徑中的關(guān)鍵酶，是能量代 謝的一個(gè)多功能復(fù)合酶。研究表明，近年來發(fā)現(xiàn) FAS 成為新的減肥和抗癌的雙重潛在靶點(diǎn)。開發(fā)具 有高活性、低毒性的 FAS 抑制劑，對(duì)癌癥的防治具 有重大的意義 。迄今為止已報(bào)道的從天然產(chǎn)物中分 離得到的 FAS 抑制劑還很少，只有最早發(fā)現(xiàn)的天然 產(chǎn)物淺藍(lán)菌素（cerulenin）和以淺藍(lán)菌素結(jié)構(gòu)為模版用化學(xué)方法合成的 C75，以及綠茶中的酯型兒茶素 表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG） 和表兒茶素沒 食子酸酯（ECG）。從天然中草藥中尋找抑制活性更 高的 FAS 抑制劑是有重大意義的。

合歡皮，安徽盛海堂中藥飲片有限公司；雞肝 （江南大學(xué)無錫醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房）；D101 大孔樹脂（批 號(hào)：20170623），滄州寶恩吸附材料科技有限公司； 層析硅膠 200-300 目（批號(hào)：2017049），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué) 試劑有限公司；GF254 硅膠板（批號(hào)：201700043）， 乳山市太陽干燥劑有限公司。 乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷均為分析 純；甲醇（色譜純，批號(hào)：13030126），美國(guó) TEDIA 公司；超純水（PALL CascadaLS），美國(guó)頗爾公司； 乙二胺四乙酸二鉀鹽（EDTA-2K，批號(hào)：327B032）， 北京索萊寶科技有限公司；二硫蘇糖醇（DTT，批 號(hào)：C10114900），上海麥克林生化科技有限公司； 乙酰輔酶 A（批號(hào)：435K022），北京索萊寶科技有限 公司；還原型輔酶Ⅱ（NADPH）（批號(hào)：1128J022）， 北 京 索 萊 寶 科 技 有 限 公 司 ； 油 酸（OA， 批 號(hào) ： 5827240），北京索萊寶科技有限公司；無游離脂肪 酸的牛血清白蛋白（BSA，批號(hào)：2626940），北京索萊 寶科技有限公司；油紅 O 染色液（批號(hào)：1219D051）， 北 京 索 萊 寶 科 技 有 限 公 司 ； EGCG（ 批 號(hào) ： 7264D102），北京索來寶科技有限公司；丙二酰輔酶 A（批號(hào)：TFGL6264K），美國(guó) Sigma 化學(xué)試劑有限公 司；棕櫚酸（PA，批號(hào)：MKBQ7543V），美國(guó) Sigma 化 學(xué) 試 劑 有 限 公 司 ； 磷 酸 氫 二 鉀（ 批 號(hào) ： 20130923），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫 鉀（批號(hào)：20160516），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公 司；碳酸氫鉀（批號(hào)：20151005），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試 劑有限公司；DMEM 培養(yǎng)基（批號(hào)：AD23420270）， 美國(guó) Hyclone 公司；胎牛血清（批號(hào)：OX0524），上 海雙洳公司；胰蛋白酶（批號(hào)：2231041），北京索萊 寶科技有限公司。 細(xì)胞培養(yǎng)皿（批號(hào)：430167），美國(guó) CORNING 公 司；12 孔板（批號(hào)：8054899），美國(guó) Thermo 公司。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52A），上海亞榮生化儀 器廠；超高速多功能粉碎機(jī)（SZ-1000A-3），永康市 善竹貿(mào)易有限公司；真空干燥箱（DZF-1），上海博泰 實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；三用紫外分析儀（ZF-1），海門 市其林貝爾儀器制造有限公司；高功率數(shù)控超聲波 清洗器（KQ-800KDE），昆山市超聲儀有限公司；分 析天平（AL104），瑞士梅特勒-托利多（上海）儀器有 限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-2），上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè) 備有限公司；循環(huán)水真空泵（SHZ-DⅢ），鞏義市予 華儀器有限責(zé)任公司；半制備高效液相色譜儀（1525 系列），美國(guó) Waters 公司；全功能微孔板檢測(cè)儀 （Synergy H4），美國(guó) BioTek 有限公司；小型臺(tái)式離 心機(jī)（MedifugeTM），南京寶誠(chéng)生物技術(shù)有限公司； 超速冷凍離心機(jī)（80 000 rpm/CP80NX 型），上海旦鼎 國(guó)際貿(mào)易有限公司。

FAS 上清液參考該方法所得，在此基礎(chǔ) 上，通過酶標(biāo)儀測(cè)定 NADPH 的變化值來測(cè)定活性。 于含有 1 mmol·L- 1 EDTA、pH 值為 7、濃度為 0.1 mmol·L-1 的磷酸鉀緩沖液中進(jìn)行，底物濃度為乙酰 CoA 6 μmol·L-1 ，丙二酰 CoA 12 μmol·L-1 ，NADPH 37.5 μmol·L-1 ，體積為 2 mL，于 37 ℃水浴恒溫 4～ 5 min，加入 50 μL 稀釋后的高速離心上清液?jiǎn)?dòng)酶 反應(yīng)，采用酶標(biāo)儀測(cè)定。每次從反映體系中吸取 200 μL 反應(yīng)體系溶液于 340 nm 波長(zhǎng)處連續(xù)監(jiān)測(cè)吸光 度變化。 動(dòng)物 FAS 的活性單位（U）規(guī)定為每分鐘氧化 14 nmol NADPH 的酶量，每毫升高速離心上清液酶活力 用下式計(jì)算：Activity(V/L) = △A340 nm ε × V × 106 14 × C。式 中：V 為測(cè)定酶活的體積數(shù) 0.000 2 L；C 為稀釋倍 數(shù)；106 為 mmol 轉(zhuǎn)換為 nmol 系數(shù)；△A340 nm 為 340 nm 波長(zhǎng)下的吸光度變化值；ε 為 NADPH 氧化為 NADP+ 時(shí)在 340 nm 波長(zhǎng)處的毫摩爾消光系數(shù)，此處 為 6.022 L·mmol-1 。 被測(cè)樣品加入反應(yīng)體系，加入 FAS 啟動(dòng)反應(yīng)， 測(cè)得酶活為 A，空白對(duì)照酶活為 A0，A/A0 為剩余活 性（R.A），R.A 越小，酶反應(yīng)抑制程度越高，表明樣 品的抑制酶活性能力越強(qiáng)。

將合歡皮藥材 2.5 kg 打 碎成粉，加入 75%乙醇，在 75 ℃下用水浴回流提取 兩次，料液比為 1∶10 g·mL-1 ，回流提取時(shí)間為 2 h。合并兩次提取液，減壓濃縮，真空干燥，得到合歡皮 總提取物 AJ-T 250 g。總提取物用蒸餾水溶解，然后 分別用乙酸乙酯、水飽和正丁醇分級(jí)萃取，萃取液 減壓濃縮，分別得到乙酸乙酯相（124.7 g）、正丁醇 相 AJ-B（52.4 g）、母液水相（23.5 g）。

取 AJ-B 干粉 20 g， 用去離子水溶解，水溶液經(jīng)過 D101 大孔樹脂柱洗 脫，依次用 3 倍柱體積的水、30%乙醇、50%乙醇、 70%乙醇、95%乙醇梯度洗脫，得到 4 個(gè)組分：30% 乙醇洗脫組分（AJ-B-1），50%乙醇洗脫組分（AJ-B2），70%乙醇洗脫組分（AJ-B-3），95%乙醇洗脫組分 （AJ-B-4）。4 個(gè)組分通過上述方法進(jìn)行酶活測(cè)定， 篩選出活性最高的組分。

通過薄層色譜 法，確定洗脫劑為二氯甲烷-甲醇。選取粒徑為 200~ 300 目硅膠分離，硅膠干法上樣，薄層色譜法實(shí)時(shí)檢 測(cè)并收集合并組分。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，共得到 6 個(gè)組分：Fr1、Fr2、Fr3、Fr4、Fr5、Fr6。6 個(gè)組分 通過酶活測(cè)定，篩選出活性最高的組分 Fr4。

Fr4 組分 采用半制備型 高效液相色譜（HPLC）對(duì) Fr4 進(jìn)行分離，使用 Waters 1525 半制備高效液相色譜儀，C18 色譜柱；流動(dòng)相： 0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B）；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm； 流動(dòng)相梯度洗脫程序：0～15 min：10%～30% B； 15～50 min：30%～38%B；50～65 min：38%～80%B； 65～66 min：80%～100% B；66～76 min：100% B； 76～80 min：100%～20%B；80～85 min：20%B。 共收集到 4 個(gè)化合物 H1、H2、H3、H4，對(duì)應(yīng) 的出峰時(shí)間為 32.35、34.4、38.9、45.72 min。酶活 測(cè)定篩選出活性最高的化合物 H2，通過 LC-MS，核 磁共振波普確定化合物 H2 為無梗五加苷 B。

根據(jù) HepG2 細(xì)胞 的生長(zhǎng)狀態(tài)，選擇高糖的含有 10%胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基，置于 37 ℃、5%CO2濕潤(rùn)環(huán)境的培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞長(zhǎng)至 80%～90%時(shí)傳代接種，選 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。將 HepG2 細(xì)胞吹散 均勻接種到 12 孔板，細(xì)胞密度為 4×105 個(gè)·mL-1 ，每 孔終體積 1 mL。造模前用無血清培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞 12 h， 在 HepG2 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)的同時(shí)以 2∶1 加入 OA 和 PA，總濃度為 1 nmol·L-1 。為去除血清中脂肪酸的干 擾，同時(shí)滿足細(xì)胞的生長(zhǎng)，采用無游離脂肪酸的 5% BSA 培養(yǎng)細(xì)胞。置于 37 ℃、5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，造模 24 h 之后，分空白組、造模組、給藥組、陽性 對(duì)照組（EGCG）。給藥處理 24 h 之后進(jìn)行油紅 O 染 色。給藥處理 24 h 之后，小心輕緩倒去培養(yǎng)液，磷 酸緩沖鹽溶液（PBS）漂洗 2 次，10%中性甲醛固定 30 min；PBS 漂洗，油紅工作液染色 20 min，60%異 丙醇脫色處理。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴染色 情況。

所有數(shù)據(jù)均以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差” （x ± s）表示，利用統(tǒng)計(jì)軟件 SPSS17.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分 析，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組 間兩兩比較采用獨(dú)立樣本 t 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有 統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

大孔樹脂不同洗脫組分對(duì) FAS 活性的抑制 通 過大孔樹脂洗脫，并且對(duì)不同的洗脫組分進(jìn)行抑酶 活性比較，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。結(jié)果如圖 1 所示。 在同一濃度的不同洗脫部位組分對(duì)脂肪酸合酶的抑 制作用結(jié)果顯示：相比較于其他組分，30%洗脫組分 （AJ-B-1）對(duì)脂肪酸合酶的抑制作用最強(qiáng)。

關(guān)于天然產(chǎn)物中抑制脂肪酸合酶活性成分的報(bào)道 有很多，但是大多是研究到其活性組分，從天然產(chǎn) 物中分離純化得到的抑制脂肪酸合酶活性的化合物 還非常少。本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期從事合歡皮 AJ-B 活性的藥 理研究，前期實(shí)驗(yàn)室的李曰研究表明：在動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 上，合歡皮 AJ-B 對(duì)脂肪酸合酶的蛋白表達(dá)水平上有 抑制作用。因此，為了比較全面地研究合歡皮中抑 制 FAS 的活性組分，我們選用合歡皮 AJ-B 作為起始 點(diǎn)。本研究以抑制 FAS 活性為導(dǎo)向篩選合歡皮正丁 醇相中的活性化合物，通過大孔吸附樹脂在不同的 乙醇濃度下洗脫，富集到抑制 FAS 活性較高的 30% 乙醇洗脫段，30%乙醇洗脫段在硅膠柱層析分離下得 到抗 FAS 活性較高的的組分 Fr4。使用半制備液相色 譜分離 Fr4，進(jìn)一步得到抗 FAS 活性較強(qiáng)的化合物 H2。結(jié)合質(zhì)譜和核磁共振技術(shù)鑒定該化合物為無梗 五加苷 B。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)上發(fā)現(xiàn)無梗五加苷 B 對(duì)腫瘤 細(xì)胞脂滴的生成具有抑制作用，我們推測(cè)其可能是 通過抑制 FAS 的活性從而抑制脂滴的生成，但其具體確切的作用機(jī)制還有待研究。因此，我們將繼續(xù) 深入研究其降脂的作用機(jī)制，期待在更深層次的藥 理機(jī)制上有所貢獻(xiàn)。