β-胡蘿卜素是類胡蘿卜素的典型代表，主要有全反式、 9-順式、13-順式及15-順式4種形式。大量研究表明，β-胡蘿 卜素能轉(zhuǎn)化為維生素A，具有抗氧化、預(yù)防癌癥、預(yù)防心血 管疾病、提高免疫系統(tǒng)等功能。β-胡蘿卜素的主要來源 有天然物提取法、化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法。天然物提取 法受產(chǎn)品原料、氣候、運輸條件的制約，成本高，產(chǎn)量較低； 化學(xué)合成法存在一定的危害。與其他方法相比，微生物發(fā) 酵法易培養(yǎng)，產(chǎn)量高，產(chǎn)品具有順式和反式混合體，更加 安全，因此得到廣泛的應(yīng)用。

菌株S3-1：本實驗室前期從土壤中分離、純化并保藏。

酵母浸粉、蛋白胨、麥芽糖（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；玉米漿：上海方畦儀器有限公 司；β-胡蘿卜素（純度≥95%）：德國Sigma公司；Ezup柱式 真菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽 提試劑盒：上海生工生物工程股份有限公司；其他化學(xué)試 劑均為國產(chǎn)分析純。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基： 青島海博生物技術(shù)有限公司。 活化培養(yǎng)基：含0.1 g/L氯霉素的PDA培養(yǎng)基，pH自然， 121 ℃滅菌20 min。 種子培養(yǎng)基：酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖 20 g/L，pH自然，115 ℃滅菌30 min。 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、酵母浸粉10 g/L、蛋 白胨20 g/L、無水氯化鈣0.5 g/L、磷酸二氫鉀0.8 g/L，pH自 然，115 ℃滅菌30 min。

FA2004W電子分析天平：上海菁海儀器有限公司； EL20-K pH計：美國梅特勒托利多公司；LDZX-75KBS立式 高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；SHZ-2A數(shù)顯氣浴 恒溫振蕩器：金壇華峰儀器有限公司；SHP-250生化培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；TDZ7-WS離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；1260高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國安捷倫 科技有限公司。

按照Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取菌株 S3-1的基因組，以其為模板，采用真菌核糖體ITS基因片段 的通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和 ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 PCR擴(kuò)增體系：模板基因組0.5 μL，10×Buffer（含20 mmol/L Mg2+ ）0.5 μL，2.5mmol/L 脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）1 μL，rTaq酶（5 U/μL）0.2 μL， 上下游引物（10 μmol/L）各取0.5 μL，雙蒸水（ddH2O）補至 25 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s， 55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共循環(huán)30次；72 ℃再延伸 10 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測 后，送生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測序。將測序結(jié) 果提交至美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行 Blast比對，選取同源性較高的模式菌株的ITS基因序列，采 用MEGA7.0軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構(gòu)建系 統(tǒng)發(fā)育樹，自展值為1 000。

菌株活化：將菌株S3-1劃線于活化培養(yǎng)基，28 ℃倒置 培養(yǎng)3 d。種子培養(yǎng)：挑取活化培養(yǎng)基上的單菌落接種于裝 液量為50 mL/250 mL的種子培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min條 件下培養(yǎng)至對數(shù)期。發(fā)酵培養(yǎng)：按6%（V/V）的接種量將種 子液接種于裝液量為40 mL/250 mL的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中， 28 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)84 h。參考楊文等的方法，采 用酸熱法進(jìn)行破壁，丙酮進(jìn)行提取，提取至菌體變白，合并 提取液，提取過程盡量避光。 在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別考察碳源種類（葡 萄糖、果糖、蔗糖、木糖、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉、甘油） 及添加量（10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L、60 g/L）、氮 源種類（酵母浸粉、蛋白胨、玉米漿、酵母浸粉+蛋白胨）及 添加量（10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L、60 g/L）、硫酸 鎂添加量（0、0.3 g/L、0.6 g/L、0.9 g/L、1.2 g/L、1.5 g/L）、初始 pH值（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）對菌體生長和β-胡蘿卜素產(chǎn)量 的影響。根據(jù)β-胡蘿卜素的產(chǎn)量和純度篩選影響顯著的因 子和最佳水平，進(jìn)行4因素3水平正交試驗，正交試驗因素 與水平見表1。

2 結(jié)果與分析

菌株S3-1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜見圖1。由圖1可 知，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物堿基長度約為574 bp，與目的基因堿基長度相符，進(jìn)行測序。

將菌株S3-1的ITS測序結(jié)果提交至NCBI的GenBank數(shù) 據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對，選取同源性較高的模式菌株的ITS 基因序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株 S3-1與近玫色鎖擲孢酵母（Sporidiobolus pararoseus）JQ2-1 聚于一支，親緣關(guān)系最近，因此，鑒定菌株S3-1為近玫色鎖 擲孢酵母（Sporidiobolus pararoseus）。韓梅等研究發(fā)現(xiàn)， S. pararoseus所產(chǎn)的β-胡蘿卜素以全反式結(jié)構(gòu)為主，全反式 結(jié)構(gòu)約占總β-胡蘿卜素的60%，順式結(jié)構(gòu)主要有13-順和9- 順β-胡蘿卜素。不同微生物對碳源的需求不同，不同碳源對發(fā)酵產(chǎn)物 的合成可能產(chǎn)生不同的作用。因此，比較8種不同碳源對菌 株S3-1產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響，結(jié)果見表2。由表2可知，當(dāng)以 蔗糖為碳源時，生物量最高，為（13.21±0.08）g/L，與葡萄糖、果糖、可溶性淀粉無顯著差異（P＞0.05），但顯著高于乳 糖、麥芽糖、甘油（P＜0.05）；當(dāng)以葡萄糖為碳源時，β-胡蘿 卜素產(chǎn)量及純度最大（P＜0.05），分別為（1.95±0.26）mg/L、 （53.91±1.47）%。因此，選擇葡萄糖作為最優(yōu)碳源。

本研究以土壤中篩選出的一株高產(chǎn)高純度β-胡蘿卜 素的菌株S3-1為研究對象，采用分子生物學(xué)技術(shù)鑒定其為 近玫色鎖擲孢酵母（Sporidiobolus pararoseus）。通過正交 試驗優(yōu)化確定菌株S3-1產(chǎn)β-胡蘿卜素的最優(yōu)發(fā)酵工藝： 葡萄糖40 g/L、酵母浸粉30 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、無水氯化 鈣0.5 g/L、磷酸二氫鉀0.8 g/L、初始pH值5.0。在最優(yōu)發(fā)酵 工藝條件下，β-胡蘿卜素產(chǎn)量為（3.08±0.46）mg/L，純度為 （60.01±2.66）%。