目前，工業(yè)化動物養(yǎng)殖為人們提供了大量廉價(jià)動 物蛋白，與此同時(shí)也造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染問題，抗生 素通過食物鏈進(jìn)入人體造成人體抗生素殘留問題以及 耐藥菌產(chǎn)生等問題。因此，尋找一系列安全、高效且價(jià) 格低廉的能夠在工業(yè)化動物養(yǎng)殖中替代抗生素的藥物 就顯得越來越重要。黃酮類化合物是一類廣泛存在于 種子、根、莖、葉等植物組織中的生物活性小分子化合 物，有很強(qiáng)的藥理作用且毒副作用小。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 香椿子

香椿子采自銅仁市萬山區(qū)謝橋街道石竹村， 60 ℃ 烘箱干燥2 h，粉碎后過60目篩，陰涼干燥處密 閉保存待用。

1.1.2 主要試劑

蘆丁對照品(中國食品藥品檢定研究院，含有量大 于98%)。無水乙醇、甲醇、石油醚、三氯化鋁、醋酸鈉、冰 醋酸、鹽酸、氫氧化鈉為市售分析純；果膠酶(5×104 U/g) 購自南寧龐博生物工程有限公司；水為超純水。

1.1.3 主要儀器

TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京普 析通用儀器有限公司)；New human power Ⅰ純水儀(韓 國Human公司)；CPA225D 型電子天平[賽多利斯科學(xué) 儀器(北京)有限公司]；CP153型電子天平[奧豪斯儀器 （上海）有限公司]；SB5200D型超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)；雷磁PHS-25型pH計(jì)（上海 儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；TDZ4-WS型臺式低速離心機(jī)（湖南赫西儀器裝備有限公司）；上海精宏DHG-9123A鼓風(fēng)干燥箱。

1.2 方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取蘆丁對照品 10 mg，置于 50 ml 容量瓶 中，以50%甲醇溶解，定容，充分振蕩混勻得0.2 mg/ml 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。用移液管分別精密移取 0.50、1.00、 2.00、3.00、4.00、5.00 ml蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于50 ml容量瓶 中，分別加入 2 ml 0.5 mol/l AlCl3溶液，搖勻，靜置 15 min，用pH值為5.8的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液定容， 搖勻后超聲震蕩5 min，得6個(gè)濃度的蘆丁測定液。 取其中一個(gè)濃度的蘆丁測定液在TU-1901型雙 光束紫外可見分光光度計(jì)上進(jìn)行光譜掃描，確定最大 吸收波長。于最大吸收波長處依次測定6個(gè)濃度的蘆 丁測定液的吸光度，用濃度校正法繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 香椿子總黃酮提取及含量測定

100 g粉碎過篩后的香椿子粉末置于1 000 ml平底 燒瓶中，加入500 ml石油醚回流提取1 h，提取兩次，合 并濾液后減壓濃縮得香椿子油脂。濾渣于通風(fēng)櫥中揮 干石油醚后60 ℃烘干，陰涼干燥處密閉保存?zhèn)溆谩?精密稱取石油醚脫脂后的香椿子粉末 0.2 g，置 于20 ml具塞玻璃管中，加入提取液（N ml），在設(shè)定條 件下進(jìn)行酶解提取。提取結(jié)束后用相應(yīng)的乙醇溶液 補(bǔ)足失重后將濾液轉(zhuǎn)移至10 ml離心管中4 000 r/min 離心10 min，上清液用移液器轉(zhuǎn)移到離心管中備用。移取1 ml濾液，加入2 ml 0.5 mol/l AlCl3溶液，搖勻， 靜置15 min，用pH值為5.8的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液 定容至 10 ml，搖勻后超聲震蕩 5 min，在 416 nm 處 測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算該溶液中總黃酮濃度 C(mg/ml)。最終計(jì)算香椿子總黃酮含有量，公式為：總 黃酮含量=(C×N×10)/0.2（mg/g）。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

1.2.3.1 酶解pH值

精密稱取5份石油醚脫脂后的香椿子粉末0.2 g，分 別置20 ml具塞玻璃管中，編號后加入含果膠酶（果膠酶 濃度為每100 ml乙醇溶液0.5 g果膠酶）的 75% 乙醇溶 液10 ml，用HCl和NaOH將pH值分別調(diào)至2.5、3.5、4.5、 5.5、6.5，在50 ℃下超聲提取20 min。按1.2.2節(jié)方法處 理樣品并測定吸光度，計(jì)算香椿子總黃酮的含量。

1.2.3.2 酶解溫度

精密稱取5份石油醚脫脂后的香椿子粉末0.2 g， 分別置20 ml具塞玻璃管中，編號后加入含果膠酶（果 膠酶濃度為每100 ml乙醇溶液0.5 g果膠酶）的 75% 乙醇溶液10 ml，pH值調(diào)至3.5，分別在35、40、45、50 、 55 ℃下超聲提取20 min。按1.2.2節(jié)方法處理樣品并 測定吸光度，計(jì)算香椿子總黃酮的含量。

1.2.3.3 酶解時(shí)間

精密稱取5份石油醚脫脂后的香椿子粉末0.2 g， 分別置20 ml具塞玻璃管中，編號后加入含果膠酶（果 膠酶濃度為每100 ml乙醇溶液0.5 g果膠酶）的 75% 乙醇溶液10 ml，pH值調(diào)至3.5，在50 ℃下分別超聲提 取10、20、30、40、50 min。按1.2.2節(jié)方法處理樣品并 測定吸光度，計(jì)算香椿子總黃酮的含量。

2 結(jié)果與分析

黃酮類化合物經(jīng) AlCl3顯色后，與鋁離子形成穩(wěn) 定的絡(luò)合物，苯甲酰基部分引起的吸收帶(300~ 400 nm)紅移，吸光度明顯增大且專屬性提高。蘆丁 經(jīng) AlCl3顯色后，其 365 nm 處吸收峰紅移至 416 nm， 且吸光度有所增加，見圖1。

在最大吸收波長416 nm處，按照1.2.1節(jié)方法繪 制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，為 C=31.7A- 1.05，R=0.999 9，在 2.0~20.0 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。酶只有在特定的pH值、溫度下才能達(dá)到最大的 活性，果膠酶的作用 pH 值為 2.5~6.0，作用溫度為 15~55 ℃。在香椿子總黃酮的酶解提取試驗(yàn)中，最佳 酶解 pH 值為 3.5，最佳作用溫度為 50 ℃。后續(xù)試驗(yàn)中，為達(dá)到最佳的提取效果，我們將pH 值調(diào)至3.5，溫度控制在50 ℃。酶的加 入，使植物中的細(xì)胞壁被破壞，其中果膠等高分子化 合物被分解為小分子物質(zhì)，有效減小黃酮等小分子化 合物的溶出阻力，以達(dá)到提高總黃酮的提取率的效 果。因此酶的用量對總黃酮的提取率的影響非常關(guān) 鍵。隨著酶用量的增大，香椿子總黃酮提取率逐漸升高，當(dāng)用量達(dá)到1.00% 時(shí)，香椿子 總黃酮提取率出現(xiàn)峰值，隨后隨著酶用量的增大總黃 酮提取率略有下降，可能原因是當(dāng)酶過量時(shí)，香椿子 粉末將會被大量的酶包裹，導(dǎo)致提取不徹底。所以我 們選用酶用量為0.75%、1.00%、1.25%進(jìn)行正交試驗(yàn)。

3 討論與結(jié)果

近年來，酶解法在提高植物有效成分的提取率方 面的研究、應(yīng)用越來越多。其主要原因是酶能使 植物體內(nèi)大分子化合物如果膠、纖維素、淀粉、蛋白質(zhì) 等分解為小分子，從而減小其對植物體內(nèi)生物小分子 化合物的束縛力，進(jìn)而提高植物有效成分的提取率。 不同的植物、植物部位以及不同的目標(biāo)化合物所需要 的酶是不同的，本實(shí)驗(yàn)考察了果膠酶、纖維素酶及果 膠酶與纖維素酶的復(fù)合酶對香椿子總黃酮提取率的影響，發(fā)現(xiàn)果膠酶能使香椿子總黃酮的提取率達(dá)到最 大，所以我們選擇果膠酶對香椿子進(jìn)行酶解。



 

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