濃香型白酒產(chǎn)銷量在各香型中位居首位，其產(chǎn)量和質(zhì) 量深度影響著我國(guó)白酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。濃香型白酒以泥窖 池為發(fā)酵容器，窖泥的質(zhì)量直接影響白酒品質(zhì)的優(yōu)劣。 窖泥中的微生物種類豐富，是釀制濃香型白酒的基礎(chǔ)。酯 化型微生物是窖泥中一類重要的功能菌。在發(fā)酵過(guò)程中， 酯化菌代謝產(chǎn)生的酯化酶使乙醇與己酸、乙酸、乳酸等有 機(jī)酸縮合，生成己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯等酯類，構(gòu) 成濃香型白酒的主體香成分。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

窖泥：賒店老酒股份有限公司。

1.1.2 化學(xué)試劑

三丁酸甘油酯（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；環(huán)己烷（分析純）：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；正己 酸（分析純）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；無(wú)水乙醇、葡萄 糖（均為分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；細(xì)菌 基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試 劑盒：天根生化科技有限公司；2×EsTaq Master Mix：北京 康為世紀(jì)生物有限公司；DL2000 Marker：北京博邁德生物 技術(shù)公司；可溶性淀粉（生化試劑）：天津市恒興化學(xué)試劑 制造有限公司；高粱粉（食品級(jí)）、玉米面（食品級(jí)）：河南省 新鄉(xiāng)市原陽(yáng)縣農(nóng)家自產(chǎn)；紅糖（食品級(jí)）：北京德眾嘉鑫經(jīng) 貿(mào)有限公司；牛肉膏、蛋白胨（均為生化試劑）：北京奧博星 生物技術(shù)有限責(zé)任公司；瓊脂粉（生化試劑）：北京索萊寶 科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L， 121 ℃滅菌30 min。 初篩培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L， 瓊脂粉20 g/L，加入三丁酸甘油酯1%，121 ℃滅菌30 min。 發(fā)酵培養(yǎng)基：牛肉膏20.0 g/L，葡葡糖20.0 g/L，K2HPO4 1.0 g/L，（NH）4 2SO4 1.0 g/L，MgSO·4 7H2O 1.0 g/L，NaCl 0.5 g/L， FeSO·4 7H2O 0.01 g/L，調(diào)pH至7.0，121 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

H1850R離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開(kāi)發(fā)有限公司； ZQLY-300S恒溫培養(yǎng)搖床：上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司； JA1003分析天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；DNP9272BS電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司； DYY-2C電泳儀：北京六一生物科技有限公司；D-37085聚 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 ：德國(guó) Senso Quest有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種分離純化

稱取5 g窖泥于45 mL無(wú)菌水中，充分振蕩，取上清液 用無(wú)菌水逐級(jí)稀釋，得到10-2～10-3稀釋度的菌懸液。吸取 上述菌懸液各100 μL，分別涂布于初篩培養(yǎng)基上，每個(gè)稀 釋度做兩個(gè)平行。將涂布均勻的平板置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱 中，培養(yǎng)24～48 h，觀察在菌落周圍出現(xiàn)的透明圈，將產(chǎn)圈 菌落于平板初篩培養(yǎng)基上劃線分離至純種。

1.3.2 菌種初篩

將分離出的菌株點(diǎn)植于初篩培養(yǎng)基中，每個(gè)菌株做三 個(gè)平行，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。觀察菌落周圍出 現(xiàn)的透明圈，記錄透明圈直徑（D）與菌落直徑（d）之比，選 取D/d值較大者進(jìn)行復(fù)篩。

1.3.3 菌種復(fù)篩

將初篩后的菌株接種于5 mL/25 mL液體培養(yǎng)基中， 30 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)19 h，取1 mL轉(zhuǎn)接于50 mL/250 mL 液體培養(yǎng)基中，同樣條件下再次培養(yǎng)19 h，以5%的接種量將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)48 h。發(fā) 酵液經(jīng)10 000 r/min離心10 min，取上清液于4 ℃保存，備用。

1.3.4 酯化酶活力的測(cè)定測(cè)定方法

于10 mL環(huán)己烷體系中加入正己酸和無(wú)水 乙醇，己酸量為6.25 mL，無(wú)水乙醇與己酸體積比為1.0∶1.8 （上述試劑每500 mL加入無(wú)水硫酸鈉30 g），并向其中加入 0.2 mL酶液，于37 ℃條件下保溫酯化24 h。吸取上清0.5 mL 于100 mL三角瓶中，加入5 mL蒸餾水，2滴酚酞，用0.05 mol/L NaOH溶液滴定至終點(diǎn)，記錄消耗NaOH溶液體積。 酯化酶酶活力定義：在37 ℃條件下，每分鐘消耗1 μmol 己酸需要的酯化酶量為1個(gè)酶活力單位（U/mL）。

1.3.5 菌種鑒定

（1）形態(tài)學(xué)鑒定 將產(chǎn)酶活力較高的菌株于固體培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)24 h， 觀察菌落的大小、顏色、表面形態(tài)、質(zhì)地、邊緣形狀和高度 等并做記錄，菌株經(jīng)革蘭氏染色觀察細(xì)胞形態(tài)，經(jīng)孔雀綠 染液染色觀察芽孢形態(tài)。
（2）分子生物學(xué)鑒定 采用試劑盒法，提取菌株S2D27的基因組脫氧核糖核 酸（deoxyribonucleic acid，DNA），用細(xì)菌的通用引物（27F 和1492R）對(duì)提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送由上 海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，選擇準(zhǔn)確 度較高的基因序列，從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索有關(guān)種的公 認(rèn)16S rDNA標(biāo)準(zhǔn)序列數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，并使用MEGA6.0構(gòu)建 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.6 菌株培養(yǎng)基優(yōu)化

最適碳源及其最適碳源添加量的確定：分別以2%的葡 萄糖、可溶性淀粉、高粱粉、紅糖、玉米面替代發(fā)酵培養(yǎng)基 中的碳源，其他成分不變。按5%的接種量，接入搖床培養(yǎng) 19 h的菌液，于30 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)48 h，測(cè)定酯化酶活 力，優(yōu)選出最佳碳源。再分別調(diào)節(jié)最適碳源添加量為1.0%、 1.5%、2.0%、2.5%和3.0%，同時(shí)測(cè)定酯化酶活力，以確定其 最適碳源添加量。 最適氮源及其最適氮源添加量的確定：分別以2%的蛋 白胨、牛肉膏、酵母浸粉、豆粕、硝酸銨替代發(fā)酵培養(yǎng)基中 的氮源，其他成分不變。接入5%的菌液，于30 ℃、150 r/min 搖床培養(yǎng)48 h，測(cè)定酯化酶活力，優(yōu)選出最佳氮源。調(diào)節(jié)最 佳氮源的添加量為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%，測(cè)定酯 化酶活力以確定其最適氮源添加量。

1.3.7 菌株發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

考察初始pH值（4、5、6、7、8）、接種量（3%、5%、7%、9%、 11%）及培養(yǎng)時(shí)間（2 d、3 d、4 d、5 d、6 d）對(duì)酯化酶活力的影響。 1.3.8 菌株發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面分析試驗(yàn)使用Design-Expert軟件，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取 豆粕添加量（A）、培養(yǎng)基初始pH值（B）、培養(yǎng)時(shí)間（C）3個(gè)對(duì)產(chǎn)酶影響較大的因素為自變量，以酯化酶活力（Y）為響 應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

菌株S2D27產(chǎn) 酯化酶活力最高，可達(dá)10.43 U/mL，其他菌株產(chǎn)酯化酶活 力在7.08～9.63 U/mL。因此，選擇菌株S2D27作為出發(fā)菌 株，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)觀察、分子生物學(xué)鑒定及最適發(fā)酵條件 的優(yōu)化。菌株S2D27的16S rDNA序列堿基長(zhǎng)度為1 480 bp 左右，與預(yù)期結(jié)果相符。擴(kuò)增產(chǎn)物送由生工生物工程（上海） 股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果于美國(guó)國(guó)家生物技術(shù) 信息中心（national center of biotechnologyinformation，NCBI） 上使用基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）分析比對(duì)，發(fā)現(xiàn)菌株S2D27與貝萊斯芽孢桿菌 （Bacillus berezoensis）同源性較高，達(dá)到99%。選取9株與菌株 S2D27同源性較高的16S rDNA標(biāo)準(zhǔn)序列數(shù)據(jù)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，菌株S2D27與Bacillus berezoensis （MG234434.1）聚于同一支，因此，鑒定菌株S2D27為貝萊 斯芽孢桿菌（Bacillus berezoensis）。

3 結(jié)論

通過(guò)透明圈法從窖泥樣品中篩選得到一株酯化酶活力 較高的菌株S2D27，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定為貝萊斯芽孢桿菌 （Bacillus berezoensis）。以此菌株為出發(fā)菌株，對(duì)其最適發(fā) 酵條件進(jìn)行了研究，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以豆粕添加 量、培養(yǎng)基初始pH值及培養(yǎng)時(shí)間為自變量，以酯化酶活力 為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。結(jié)果表明，在豆粕添加量為 1.3%、初始pH值為5，培養(yǎng)時(shí)間3 d條件下，菌株酯化酶活 力可達(dá)17.25 U/mL，是優(yōu)化前的1.65倍。

 

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